（一）DNA片段的回收与连接
在本实验中，目的DNA片段的回收采用的是北京鼎国生物技术发展中心的DNA回收/纯化试剂盒（表4-1）。
表4-1 DNA回收试剂盒的组成

DNA片段回收方法如下：
（1）切取含DNA片段的琼脂糖（100mg-300mg），用吸头捣碎，按重量比1：3（切取重量与溶液的A体积比）加入溶液A；
（2）50-65℃水浴5-10min，待凝胶全部溶化，其间振荡助溶2-3次，加入15μL溶液B，充分混匀；
（3）将溶液置于离心柱中，静止2min，10000rpm离心30s，若一次加不完，可分两次离心；
（4）倒掉液体，加500μL溶液C于离心柱中，10000rpm离心30s，弃液体；
（5）重复步骤（4）一次；
（6）12000rpm离心1min，甩干剩余液体，除去残余的酒精；
（7）将离心柱放置于新的离心管中，室温敞开离心管盖，放置10min，使乙醇挥发殆尽；
（8）加入20μL溶液D（50℃水浴），静止2min；
（9）15000rpm离心1min，管底溶液即为所需的DNA；
（10）将DNA储存于贮存于-20℃冰箱中。
（11）按照表4-2配制连接溶液，16℃连接过夜。
表4-2 目的片段与pMD 18 T-vector连接反应体系

（二）大肠杆菌感受态细胞的制备
（1）大肠杆菌DH5α、BL21（DE3）的甘油菌按1：100接于3mL的LB液体培养基的试管中，37℃摇床培养过夜；
（2）取1mL菌液转接到100mL的LB液体培养基的锥形瓶中，37℃震荡培养1-2h；
（3）将菌体转移到50mL的已灭菌的冰预冷的离心管中，冰上放置10min；
（4）4000rpm，4℃离心10min，收集菌体细胞；
（5）倒掉培养液，将离心管倒置1min，以便培养液彻底流尽；
（6）用冰预冷的0.1mol/L caCl2溶液10mL悬浮沉淀细胞，冰浴30min；
（7）4000rpm低温离心10min，收集菌体细胞；
（8）用冰预冷的0.1mol/L caCl2溶液2mL悬浮沉淀细胞，置于冰上；
（9）分装细胞，每100μL装于一个微量离心管中；
（10）每个100μL细胞中加入等量40%甘油溶液，混匀，-70℃保存。
（三）重组子转化大肠杆菌
制备含抗生素的蓝白斑筛选琼脂平板：
（1）将刚灭完菌的LB固体培养基待冷却到60℃左右，加入抗生素、混匀，倒入培养皿中；
（2）待培养基凝固后，在琼脂平板上加入40μL的20mg/mL的X-gal和4μL的200mg/mL IPTG溶液，用涂布器涂匀；
（3）避光保存3h，以利于IPTG和X-gal的吸收。
重组子的转化主要步骤：
（1）取200μL甘油保存的感受态细胞，低温融化后，加入5μL重组质粒，混匀，冰上放置30min；同时做两个对照，即200μL感受态细胞、不加任何质粒DNA和200μL感受态细胞、加入不带外源DNA的空载体；
（2）将转化的混合物立即放入42℃循环水浴中90s，不要晃动；
（3）冰浴2min；
（4）在转化子中加入600μL不含抗生素的LB液体培养基，37℃摇床培养1h；
（5）5000rpm离心5min，沉淀细菌细胞；
（6）吸弃约500μL上清液，将沉淀与剩余的上清混匀，分为100μL和200μL分别涂在制备好的含Amp的琼脂平板上，阴性对照的转化混合物，一部分涂于含Amp的琼脂平板，一部分涂于不含Amp琼脂平板上，检测感受态细胞是否污染；
（7）待菌液完全被吸收后，37℃倒置培养12-16h。
（四）重组质粒的酶切鉴定
挑取琼脂培养板上的“白斑”单菌落，移至3mL LB（Amp+）液体培养基中，37℃剧烈摇荡培养过夜，应用实验三方法提取质粒pMD 18 T-cspA1、pMD 18 T-cspA2以及pMD 18 T-cspA3，电泳鉴定。
选用Bgl II/Kpn I双酶切鉴定pMD 18 T-cspA1、pMD 18 T-cspA2以及pMD 18 T-cspA3质粒连接方向。先将pMD 18 T-cspA、Kpn I、10×L buffer以及dH2O混合（表4-3），37℃保温3h后，用冰预冷的无水乙醇-20℃沉淀DNA 30min，15000rpm高速离心，70%乙醇洗涤；在加入Bgl II、10×H buffer以及dH2O进行第二步酶切。加入10×loading buffer后进行琼脂糖凝胶电泳。
表4-3 连接方向鉴定反应体系

    示例一：