三、质粒抽提实验方法

    质粒提取过程如下:
     (1)将琼脂培养板上的阳性单菌落,移至3mL LB液体培养基中(含Amp或Kana),或将大肠杆菌的甘油菌按1:30的比例接到LB液体培养基中,37℃剧烈摇荡培养过夜;
     (2)取500μL菌体,与40%甘油等体积混合,-70℃保存,剩余的菌体用于质粒的提取;
     (3)取出1.5-2mL菌液移至Eppendorf管中,12000rpm,4℃离心30s,弃上清,用1mL STE悬浮菌体沉淀,洗涤菌体,再离心回收菌体;
     (4)再重复用STE漂洗菌体,离心后,去尽上清液;
     (5)将细菌沉淀悬浮于100μL冰预冷的溶液I中,强烈振荡混匀;
     (6)加入200μL新配制的溶液II,轻轻颠倒离心管5次以混合内容物,不要强烈振荡,放置冰上3min左右(根据不同菌株,可适当缩短);
     (7)加入150μL冰预冷的溶液III,轻轻颠倒5次,混匀,置于冰上5min;
     (8)15000rpm,4℃离心5min,将上清转移到另一个离心管中;
     (9)向上清中加入等体积的酚:氯仿(1:1),混匀,15000rpm离心5min,将上清转移到另一个离心管中;
     (10)加入2倍体积冰预冷的无水乙醇,室温放置2min,沉淀双链DNA;
     (11)15000rpm,4℃离心5min;
     (12)倒掉上清,使液体尽量流尽,空气中干燥沉淀;
     (13)用20μL含有RNaseA的TE缓冲液溶解核酸沉淀,瞬时离心,混匀,贮存于-20℃冰箱中备用。

 

 

 
 

 

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